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大鼠机械通气所致肺损伤时p38MAPK通路的激活

时间:2010-08-23 14:05:13  来源:  作者:

机械通气所致的肺损伤(Ventilator-induced lung injury, VILI)是肺功能严重受损的病人行机械通气支持治疗时的常见并发症,其主要致病机制之一可能是由于过度的机械刺激(如牵拉、切变力等)激活了肺细胞内多种和炎症密切相关的信号转导通路,使各种致炎因子的表达增多,引起白细胞在肺组织“募集”,从而造成肺损伤[1,2,3]p38信号转导通路是和炎症反应密切相关的信号转导通路,其激活后可介导多种致炎细胞因子的表达。本研究检测了不同通气方式时p38MAPK以及多种致炎因子的表达水平,研究p38在机械通气所致肺损伤中的作用。

材料与方法

主要试剂  Trizol提取液、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、ELISA试剂盒均购自深圳晶美生物工程有限公司,总蛋白和MPO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所兔抗p38p-p38抗体BioVision公司产品。

动物与分组  30只健康SD大鼠随机均分成ABC三组,每组各10例。A组:潮气量(VT)=8 ml/kg,呼吸频率(P)=80/minPEEP0B组:潮气量(VT)=20 ml/kg,呼吸频率(P)=80/minPEEP0C组:潮气量(VT)=40 ml/kg,呼吸频率(P)=80/minPEEP0ABC两组机械通气时间均为2h

动物模型  20%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠,起效后行气管切开,插入气管导管(用16号静脉穿刺套管针外套管自制)行机械通气,机械通气参数统一设置为:潮气量(VT)同上,呼吸频率(RR):80/min,吸/呼比(I:E)为11PEEP为零,吸入气体为室内空气。皮下切开行股静脉穿刺置管,静脉给阿曲库铵维持肌松。颈内动脉穿刺置管,监测动脉血压、心率等。

标本留置  机械通气达到预定时间后,放血处死大鼠。小心分离左右两侧完整肺组织,部分右侧肺组织用多聚甲醛溶液固定,用于病理切片检查,部分右侧肺组织直接放入液氮中保存待检。左肺用生理盐水行肺灌洗(2ml×3次),回收的肺灌洗液应大于90%。回收后立即离心10分钟(2000 r/min, r=8cm),沉淀物用PBS缓冲液稀释后行白细胞计数,上清于-70℃冰箱保存待检。

检测指标  对于肺组织标本,具体检测各组肺组织中p38、磷酸化p38p-P38)、细胞粘附分子(ICAM1)的水平,并检测肺组织中中性粒细胞髓过氧化物酶(MPO)的水平;对于肺灌洗液标本,具体检测肺灌洗液中TNF-aMIP-2总蛋白浓度以及白细胞计数等具体方法如下:

总蛋白和MPO  肺灌洗液中总蛋白的测定采用考马斯亮兰染色法,采用UV-2000型分光光度计测量吸光度;肺组织中MPO活性测定采用专用MPO试剂盒,先准确称取肺组织重量,按重量体积比用匀浆缓冲液(试剂盒中自备)进行匀浆,其后所有步骤均严格按照试剂盒进行,最后用UV-2000型分光光度计测量特定波长下吸光度。MPO活性单位定义为:每克肺组织湿片在37℃反应体系中H2O2被分解1umol为一个酶活力单位。

TNF-a和MIP-2  肺灌洗液中TNF-a、MIP-2的水平采用双抗体夹心ELISA法。所有操作均严格按照试剂盒说明进行,先在酶标仪上测量标准品吸光度并绘制出标准曲线,然后测量样品吸光度,并根据测得的吸光度在标准曲线上读出样品的浓度。

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR  肺组织中细胞粘附分子ICAM-1基因的表达水平采用RT-PCR的方法。RT-PCR具体方法如下。(一)RNA的提取。准确称取100mg肺组织,匀浆后按Trizol一步法进行RNA抽提。(二)RNA逆转录。抽取1ugRNA,按逆转录试剂盒所提供的方法合成cDNA。(三)PCRPCR反应体系包括:cDNA 4ulBuffer 5uldNTP 1ul,引物的正义链和反义链各1ulMgCl2 4ulTaq1ul,加水至50ul。内参采用管家基因磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。PCR反应设定如下,先95℃预变性4-5min,然后扩增30-35个循环,每个循环包括如下步骤,变性:94℃-30s;退火:55℃-30s(GAPDH),60℃-30s(ICAM-1);延伸:72℃-45s。最后72℃延伸7min,4℃终止反应。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统采集图像,用图像分析软件(Imagemaster)分析目的基因片段OD值。ICAM1特异引物为,正义链:

5’ AGACACAAGCAAGAGAAGAAAAGG 3’,反义链:5’ TTGGGAACAAAGGTAGGAATGTAT 3’,目的基因片段长度为425bp GAPDH特异性引物为正义链:5’ TGAAGGTCGGTGTCAACGGATTTGGC 3’,反义链:5’ CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC 3’,目的基因片段长度为983bp

Western blot检测p38、磷酸化p38表达  取大鼠右侧肺组织,分别剪碎,各加入一定比例裂解液 ,冰浴条件下进行组织匀浆; 4, 10000 r /min(r=8cm)离心,弃除沉淀,考马斯亮蓝法定量。每份样本取等量总蛋白,10%变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳。将蛋白转移至硝酸纤维素膜后于5%的脱脂牛奶中封闭3 h,加入11 000稀释的一抗(兔抗p38p-p38抗体), 4过夜。膜漂洗后加入12 000稀释的二抗,室温下摇床杂交1 hECL化学发光法检测阳性信号。采用Bio-Rad Gel Doc1000成像系统采集X线片上的试验结果图像,用图像分析软件(Image master)分析图像条带,并计算其积分光密度。

统计学处理  测定值用x±s,用SPSS10.0软件进行单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

 

病理学改变   A组肺组织无明显病理改变,肺泡间隔正常,偶见少量的炎性细胞以及巨噬细胞,肺泡腔无明显渗出物;B组肺组织可见一定的炎性损伤性改变,肺泡间隔增厚,肺泡腔内可见一定数量的炎性细胞,部分肺泡腔内有渗出液;C组肺组织病理改变明显加重,肺泡间隔明显增厚,肺泡腔可见较多的炎性细胞浸润,肺泡腔有较多的渗出物。

Western Blot检测各组大鼠肺组织p38p-p38的表达。结果表明,ABC三组肺组织p38的表达水平无显著性差异(p>0.05);和A组比较,Bp-p38的表达水平显著性增高(p<001);和B组比较,Cp-p38的表达水平也显著性增高(p<001)。图2、图3

AICAM-1仅有较微弱的表达,B组的表达水平显著性增高(p<0.01)CICAM-1的表达水平也显著性高于B(p<0.01);和A组比较,B组总蛋白、白细胞计数、MPOTNF-aMIP-2值等各项指标均显著性增高(p<0.01);和B组比较,C组总蛋白、白细胞计数、MPOTNF-aMIP-2值等各项指标也显著性增高(p<0.050.01)。见图4、表1

参考文献

1. Liu MY, Tanswell AK, Post M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol, 1999, 277: 667-683.

2. Li LF, Quyang B, Choukroun, etal. Stretch-induced IL-8 depends on c-Jun NH2-terminal and nuclear factor-kB-inducing kinases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2003, 285: 464–475.

3. Held HD, Boettcher S, Hamann L, et al. Ventilation-induced chemokine and cytokine release is associated with activation of nuclear factor-kappaB and is blocked by steroids. Am J Respir Crit Care Med, 2001 163: 711-716.

4. 张新日 杜永成 姜宏英  中性粒细胞活化在呼吸机所致肺损伤中的作用. 中国危重病急救医学,200517367369. 

5. Nick JA, Avdi NJ, Young SK, et al. Common and distinct intracellular signalling pathways in human neutrophil utilized by platelet activating factor and FMLP. J Clin Invest, 1997, 99:975-986.

6. Zu YL, J Qi, Gilchrist A, et al. p38 Mitogen-activated protein kinase activation is required for human neutrophil function triggered by TNF-a or FMLP stimulation. J. Immunol,1998,160:1982.

7. Detmers PA, Zhou D, Polizzi E, et al. Role of stress-activated mitogen-activated protein kinase (p38)in b2-integrin-dependent neutrophil adhesion and the adhesion-dependent oxidative burst. J Immunol, 1998, 161:1921-1929.

8. Nick JA, Young SK, Brown KK, et al. Role of p38 Mitogen-Activated Protein Kinase in a Murine Model of Pulmonary Inflammation. The Journal of Immunology, 2000, 164: 2151–2159.

9. Oudin S, Pugin J. Role of MAP Kinase Activation in Interleukin-8 Production by Human BEAS-2B Bronchial Epithelial Cells Submitted to Cyclic Stretch. Am J Respir Cell Mol Biol, 2002, 27: 107-114.

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