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Pathological Pain and Signal Transduction

吴飞翔 博士　俞卫锋 教授

第二军医大学东方肝胆外科医院麻醉科，上海 200438

Fei－xiang Wu，Wei－feng YU Department of Anesthesiology，Eastern Hepatobilliary Surgery Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200438

Abstract

　　Pathological pain，consisting of tissue injury－induced inflammatory and nerve injury－induced neuropathic pain，is an expression of neuronal plasticity. One component of this is that the afferent input generated by injury and intense noxious stimuli triggers an increased excitability of nociceptive neurons in the spinal cord. This central sensitization is an activity－dependent functional plasticity that results from activation of different intracellular kinase cascades leading to the phosphorylation of key membrane receptors and channels，increasing synaptic efficacy. Central sensitization is both induced and maintained in a transcription－independent manner. Several different intracellular signal transduction cascades converge on MAPK （mitogen－activated protein kinase），activation of which appears to be a master switch or gate for the regulation of central sensitization. In addition to posttranslational regulation，the MAPK pathway may also regulate long－term pain hypersensitivity，via transcriptional regulation of key gene products. Pharmacological intervention targeted specifically at the signal transduction pathways in nociceptive neurons may provide new therapeutic opportunities for pathological pain.

　　Key Words：Pathological pain；MAP kinase；Central sensitization；Neuronal plasticity；Signal transduction.

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　　在病理性疼痛状态下，外周的伤害性冲动不断传入脊髓背角，使兴奋性氨基酸谷氨酸和神经肽P物质释放增多，引起伤害性神经元细胞膜持续去极化，去除Mg²⁺对NMDA受体通道的阻挡，使钙离子大量内流。细胞内钙离子的增加导致钙离子依赖性的酶的激活，如PKC、PKG、CaMK等。细胞内各种信号转导通路发生改变，最后集中于MAPK，MAPK激活CREB，诱发基因表达的改变，使神经元功能发生长时期的变化。

　　一、细胞内的信号转导与痛觉过敏

　　兴奋性氨基酸谷氨酸和神经肽P物质在中枢敏化中起重要作用，这两种神经递质作用于电压门控的钙通道、离子型受体和代谢型受体，导致钙离子内流及钙库内钙离子的释放，细胞内钙离子的增加导致钙离子依赖性的酶的激活，如PKC、PKG、CaMK。另外，钙／钙调素依赖性蛋白激酶激活腺苷酸环化酶，导致cAMP的增加和PKA的激活。G蛋白耦联受体还可以钙依赖性方式同PKA耦联。

　　1. 蛋白激酶C

　　蛋白激酶C(PKC)共有12种亚型，其中PKCy亚型为神经系统所特有。在不同的疼痛模型中，有证据表明PKC在背角神经元中表达对痛觉过敏起重要作用，外周的神经损伤和伤害性刺激都可使脊髓膜结合的PKC增加^[1]。有趣的是，在PKC的y亚型缺失的小鼠中，神经病理性疼痛和炎症性疼痛减轻，而急性疼痛仍可持续。这种亚型的PKC仅在背角II层的某些神经元中表达^[2]。PKC的e亚型主要在初级感觉神经元中表达，在外周的敏化中起重要作用。

　　PKC介导NMDA受体磷酸化，是由于去除了电压依赖性的Mg²⁺，使其可被谷氨酸化通过NMDA离子通道产生巨大的内向电流，从而使更多Ca²⁺内流，胞内Ca²⁺浓度的升高反过来又可促进PKC的活化^[3]。而最近研究发现，PKC可直接作用于aPMA受体，对于NMDA是间接作用。PKC亦可能通过磷酸化抑制y-氨基丁酸受体而降低抑制性中间神经元的传递作用，使神经元敏感化。PKC还可使代谢型谷氨酸受体磷酸化，影响其介导的突触可塑性和神经元兴奋性。

　　2. NO/cGMP/PKG信号道路

　　一氧化氮(NO)是一种非经典的信使分子，对靶细胞的直接作用是活化鸟苷酸环化酶从而升高cGMP水平，后者可触发一系列生物学效应。有研究表明，NMDA-NO-PKC系统能引起脊髓可塑性变化，导致中枢敏化。在研究NMDA产生热痛觉过敏时发现，鞘内给予NO合成阻断剂和PKC抑制剂，可明显减轻大鼠的痛觉过敏。在福尔马林诱导的疼痛大鼠模型中，NO阻断剂可明显减轻痛觉过敏及黑色神经元(Dark neurons)的产生^[4]，具有神经元保护作用。

　　NMDA引起的钙离子内流亦可激活NO/cGMP/PKG信号道路，阻断此通路可缓解辣椒素、福尔马林、外周神经病变诱导的疼痛。伤害性刺激和神经损伤后DRG内NOS(NO合成酶)明显增加，用NOS抑制剂或基因敲除NOS可减轻福氏完全佐剂诱导的痛觉过敏^[5]。福氏佐剂诱导的炎症反应中背角内cGMP的水平亦明显增加。

　　3. 蛋白激酶A

　　cAMP依赖性的PKA与中枢和外周敏化有关。前列腺素E₂(PGE₂)诱导的炎症反应中，AC-cAMP-PKA通路可介导外周伤害感受器的敏化^[6]。PKA增强兴奋性氨基酸对脊髓背角神经元的兴奋作用，并抑制阿片肽的抗伤害作用。研究表明，PKA参与福尔马林和辣椒素诱导的机械性超敏的二期伤害性反应，激活的PKA参与AMPA/Kainate介导的疼痛反应^[7]。在PKA I型调节亚单位(RIb)缺失突变的小鼠中，发现炎症和组织损伤诱导的疼痛行为明显减少，可见RIb亚单位对于组织损伤引起的伤害感觉性疼痛是必需的。

　　4. 钙／钙调素依赖性蛋白激酶

　　钙／钙调素依赖性蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent kinase，CaMK)在痛觉过敏中的作用现知之甚少，仅已知CaMKII的a亚单位与长时程突触可塑性改变有关。活性形式(自磷酸化)的aCaMKII可增强背角神经元内突触传递的兴奋性。原位杂交在脊髓内仅发现中等水平的aCaMKII，但在背角浅层发现aCaMKII抗体的强染色^[8]。另一亚型CaMKIV在细胞核和30％的DRG神经元的胞浆中提呈，CaMKIV可沿坐骨神经转运，推断在背角突触前具有一定的功能。但在伤害性刺激和痛觉过敏中的作用还需进一步研究。

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　　二、MAPK在伤害性神经元的信号转导与病理性疼痛

　　上游的各种信号转导通路都会聚于MAPK（mitogen－activated protein kinase）。MAPK是丝氨酸/苏氨酸激酶家族，可磷酸化丝氨酸和苏氨酸残基。可信证据表明，MAPK级联反应在所有细胞的信号从胞外到胞内传递中起关键性作用。MAPK家族具有三个成员：细胞外信号调节激酶（the extracellular signal－regulated kinases，ERKs）， c－Jun末端激酶（c－Jun N－terminal kinase，JNK）， 以及p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen－activated protein kinase，p38 MAPK）。经典认为MAPK可调节细胞的增殖、分化和存活，现认为其在神经元可塑性调节中具有重要的作用。

　　1. ERK/MAPK激活与神经元可塑性改变

　　在中枢神经系统神经元中，以下机制可激活ERK1／2； （1）细胞内Ca²⁺增高通过激活Ras强烈激活神经元ERK1／2； （2）Ca²⁺内流通过Ca²⁺／CaM敏感的腺苷酸环化酶（AC）使细胞内cAMP增加，cAMP与小G蛋白Rapl耦联激活ERK1／2。（3）神经递质受体通过PKC和PKA与激活的ERK耦联。各种上游的调节物汇聚于ERK，使其作为最初的效应器，可强烈激活ERK，其中任何一条通路的传入失败都可通过其它通路互补。

　　ERK在脊髓后角神经元的激活具有伤害性刺激特异性。在大鼠后脚底注入辣椒素1分钟后，即可在脊髓背角检测到ERK的激活。辣椒素注入后，在同侧背角浅层的中部，即伤害性传入神经纤维终止处，可发现磷酸化的ERK（pERK）标记的神经元。温度（热、冷）和机械性（刺、戳）伤害性刺激可诱导pERK，而非伤害性刺激如触摸则不能^[9]。伤害性刺激诱导的pERK的激活可被NMDA受体阻滞剂所减弱。

　　福尔马林诱发大鼠短期的疼痛模型中，鞘内注射ERK上游的激酶MEK抑制剂PD98059可阻断pERK的激活，并以剂量依赖性的方式减轻痛觉过敏，且不影响机械性、热伤害性刺激诱发的基础疼痛^[8]。这表明ERK在背角激活产生痛觉过敏，是以非转录依赖性的方式在短期内起效（30～60分钟）。ERK可能通过直接或间接（干扰某些激酶）方式磷酸化某些关键性的底物如受体、离子通道和激酶，产生翻译后修饰，从而调节膜的兴奋性和突触的可塑性。

　　在大鼠CCI的神经病理性疼痛模型中，鞘内注射ERK抑制剂U0126或ERK反义寡核苷酸可减弱机械性的超敏和痛觉过敏。CCI亦可显著增加pCREB和Fos的表达，在双侧脊髓各层均可见pCREB阳性的神经元，而Fos仅在同侧的I和II层中表达^[10]，这说明ERK信号通路与CCI诱导的神经病理性疼痛有关，且pERK部分是通过cAMP 反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）依赖性的基因表达起作用。

　　2. p38 MAPK和炎症反应

　　紫外线、热休克、脂多糖、细胞因子（IL－1β）、TNF－α可激活p38。p38上游的激酶为MAPK激酶3和6（MKK3、MKK6）。p38MAPK下游的激酶是MAPK激活的蛋白激酶 （MAPK activated protein kinase，MAPKAPK）－2/3。它能使CREB和转录因子－2（ATF－2）的丝氨酸磷酸化。活化的p38MAPK还可激活转录因子MEF2C、ELK－1、ATF－2、MAX、CHOP和CREB^[11]。p38MAPK可控制多种转录因子的基因表达活性，影响多种细胞因子的产生，调节一氧化氮和细胞骨架蛋白的合成，参与应激条件下细胞的免疫调节、炎症反应和细胞凋亡等过程。

　　最近发现，p38MAPK通过调节某些致痛因子的激活在疼痛的发生中起作用，还可通过调节核内基因转录和蛋白质翻译在病理性疼痛的维持阶段起重要作用。大鼠后爪注射辣椒素，引起注射周围皮肤和相应脊髓节段p38MAPK增加，皮下、腹腔及鞘内注射p38MAPK的抑制剂SD－282均能减轻热痛觉过敏^[12]。说明外周和脊髓的p38MAPK参与辣椒素诱导的热痛觉过敏，究其机制，离体实验SD－282能减轻皮肤辣椒素引起的降钙素基因相关肽（CGRP）的释放。

　　Jin等^[13]在脊神经结扎（SNL）模型中发现，脊髓损伤侧相应节段磷酸化的p38MAPK明显增多，而且完全位于小胶质细胞，持续时间从12h或1d到超过3周，与小胶质细胞活化时间一致； 而且，抑制脊髓p38MAPK减轻疼痛的过程早于DRG细胞p38MAPK激活，说明脊髓小胶质细胞p38MAPK活化对于神经病理性疼痛的早期诱发具有重要意义。DRG和脊髓小胶质细胞p38MAPK的后期共表达在时间上具有重叠性，表明两者对于神经病理性疼痛的后期阶段均起作用，而且p38MAPK在神经病理疼痛中的诱发作用大于维持作用。小胶质细胞表达COX2、诱发型一氧化氮合酶（iNOS）和多种细胞因子，p38MAPK可能通过调节这些物质的转录及翻译在疼痛发生过程中起作用。

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15. Michael GJ，Priestley JV. Differential expression of the mRNA for the vanilloid receptor subtype 1 in cells of the adult rat dorsal root and nodose ganglia and its downregulation by axotomy. J Neurosci，1999；19：1844－1854.

16. Kenney，AM，Kocsis JD. Peripheral axotomy induces long－term c－Jun amino－ terminal kinase－1 activation and activator protein－1 binding activity by c－Jun and junD in adult rat dorsal root ganglia in vivo. J Neurosci，1998；18：1318－1328.

17. Widmann C，Gibson S，Jarpe MB，et al. Mitogen－activated protein kinases：Conservation of a three－kinase module from yeast to human. Physiol Rev，1999；79：143－80.

18. Ji RR，Kohno T，Moore KA，et al. Central sensitization and long term poten tiation－do pain and memory share similar mechanisms Trends Neurosci，2003； 26：696－705.

19. Ahn S，Riccio A，Ginty DD. Spatial considerations for stimulus－dependent transcription in neurons. Annu Rev Physiol，2000；62：803－823.

20. Ji RR，Rupp F. Phosphorylation of transcription factor CREB in rat spinal cord after formalin－induced hyperalgesia：relationship to c－fos induction. J Neurosci，1997；17：1776－1785.

21. Yasuhiko Kawasaki，Tatsuro Kohno，Zhi－Ye Zhuang. Ionotropic and metabotropic receptors，protein kinase A，protein kinase C，and Src contribute to C－fiber－induced ERK activation and cAMP response element－binding pro tein phosphorylation in dorsal horn neurons，leading to central sensitization. J Neurosci，2004；24：8310－8321.

22. Ru－Rong Ji，Clifford J. Neuronal Plasticity and Signal Transduction in Nocice ptive Neurons：Implications for the Initiation and Maintenance of Pathological Pain. Neurobiology of Disease，2001；8：1－10.