The effect of Xue Bijing to level of serum inflammatory mediators and TH1/TH2 of spleen in sepsis rats.

   zhang Shuwen, Sun Chendong Wen yan Yin Chenghong  Department of infection, Beijing Friendship Hospital affiliate of Capital University of Medical Sciences , Beijing,100050,China

脓毒症(sepsis)及序贯的多脏器功能不全综合征(MODS)仍是当前困扰医学界的难题。据推算我国每年可能有300万例患者发生脓毒症^[1]，脓毒症表现出的患病率高、死亡率高、治疗费用高的三高现象已经构成对人类健康的严重威胁和经济发展的巨大负担。因此深入研究脓毒症的病理生理机制以及研制治疗脓毒症的新药成为当前研究的热点。脓毒症的促炎、抗炎的失衡已经为医学界所公认，寻求调节免疫平衡的药物成为治疗脓毒症发展的一个重要方向，我们在临床应用中发现血必净对于脓毒症患者具有较好的免疫调理作用，本实验主要观察该药对脓毒症大鼠的免疫调节作用的影响。

1试验材料与实验方法

1.1试验材料：体重270~290g的雄性SD大鼠，购买于北京市实验动物供应中心；血必净为天津红日药业生产，批号为：041202；利复星为双鹤药业生产，批号为0503112：流式细胞仪；超净工作台、压力蒸汽消毒锅、电热干燥箱、酸缸、CO₂培养箱、倒置显微镜、液氮罐、纯水器，TH1/TH2试剂盒；显微镜OLYMPUS、酶标仪（SLT型，奥地利）。

1.2试验方法：

1.2.1动物模型的建立及分组：

   实验室室温24～26℃。实验动物饲养3d以上，术前称重，大鼠采用0.1%戊巴比妥钠按照0.4ml/100g剂量腹腔注射麻醉后，沿腹正中线作一1.5cm长的切口，在血管弓内结扎末端1／2盲肠，用7头号皮针头在盲肠上穿通2次形成盲肠漏，不留置一条橡皮条防止针孔闭合，然后将盲肠还纳腹腔，10号丝线逐层缝合腹壁切口，术毕，立即皮下注射林格平衡液50ml/kg抗休克，对照组动物只开腹、关腹与复苏，但盲肠不结扎与穿孔，动物随机分为6组：对照组(18只)、脓毒症模型组（18只）和抗生素（利复星）组(18只)，血必净组（18只）每只大鼠于晨8时给予食物20g，自由饮水。各组大鼠观察至3、24、72小时时相点处死，分别留取血液与组织标本待测。

1.2.2给药方法：

   术前半小时给予各组灌药，假手术组、模型组給予等容量的生理盐水，各组按照1ml/100g的容量给药，每天同一时间点给药。

1.2.3指标项目及检测方法

   处死动物后取血清应用ELASA的方法检测TNF-a与IL-10，处死动物无菌取动物脾脏，应用流式细胞仪监测TH1／TH2，方法：制备脾细胞悬液，取5×10⁶个脾细胞与混合刺激剂（PMA50mg/ml,离子霉素1ug/ml，莫能菌素3ug/ml.,sigma公司）混合，37℃，5％的CO₂孵育。PBS洗涤细胞，300G离心后3只试管，标记对照、INF-r、IL-4分别加入1.5×10⁶细胞，再在3只试管中依次加入PerCP-CD8 5ul,FITC-CD3 2ul室温，避光孵育30分钟。洗涤离心分别加溶血剂1ml。离心弃上清。3只试管中分别加入4％多聚甲醛750ul，加入 0.1％皂素750ul(含10％正常鼠血清，室温避光后离心，弃上清。在对照管中加同型对照5ul，在IFN- r管中加INF-r20ul，在IL-4管中加入IL-4 5ul，室温避光30分钟。用0.1％皂素洗涤一次，离心弃上清。用500ul0.01mmol/LPBS悬浮细胞，上机检测。以SSC/CD3作点图，取CD3阳性的细胞群作门（R1），取R1内的细胞，以CD8/INF-r和CD8/IL-4做点图，读取CD8/INF-r细胞群数百分数为Th1细胞百分数，读取CD8/IL-4细胞群百分数为Th2细胞百分数。两组的比值即为Th1/Th2，应用HE染色病理切片检测肝、脾、胸腺的结构变化并观察其病理改变。

1.3统计学处理

   实验数据用SPSSl1.0软件包进行统计处理。统计学方法:所有数据(ｘ±ｓ)表示，方差齐、数据成正态分布者，计量资料采用方差分析，组间比较采用q检验，计数资料采用卡方检验；如果数据分布不正态，或方差不齐，采用秩和检验。以p<0.05为差异具有显著性。

2.结果

2.1不同组别TH1/TH2的比较

   3小时与模型组比较，各组则明显下降，模型组炎症反应明显亢进，与正常组比较除了模型组以外，利复星组与血必净组无差别(p>0.05)，24小时模型组比值开始下降，与模型组比较利复星组无差别，正常组与血必净组则明显降低，与利复星组比较正常组与血必净组也明显下降(p<0.05)，血必净比正常组的比值是明显升高的；72小时模型组比利复星组明显下降，仅血必净组与各组比较是明显升高的，其他各组比较无差别(p>0.05)。

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