The effect of Xue Bijing to level of serum endotoxin and specific immunological function of spleen in rats with sepsis.

Zhang Shuwen, Sun Chendong   Department of infection, Beijing Friendship Hospital affiliate of Capital University of Medical Sciences , Beijing,100050,China

目前，脓毒症(sepsis)仍是重症加强治疗病房(icu)中患者死亡的主要原因。随着对脓毒症致病机制和宿主对脓毒症反应基因学基础的研究，人们逐渐认识到机体免疫状态紊乱在脓毒症发生发展中起着重要的作用。血必净注射液在临床应用中己取得了良好的效果，本实验主要观察血必净注射液对脓毒症大鼠特异性免疫功能的影响。

1试验材料与实验方法

1.1试验材料：体重270~290g的雄性SD大鼠，购买于北京市实验动物供应中心；血必净为天津红日药业生产，批号为：041202；利复星为北京双鹤药业生产，批号为：0503112内毒素试剂盒（上海伊华医学科技有限公司），批号20050402；大鼠TNF-a试剂盒（RapidBio Lab Calabassas California USA，批号11040502）；大鼠IL-10试剂盒（RapidBio Lab Calabassas California USA，批号11040502）；国产B600型低速离心机。BD公司生产的流式细胞仪（型号FACSC alibur）试剂：BD pharminger 公司：.R-PE标记的小鼠IgG1-PE同型对照;FITC标记小鼠抗大鼠CD3。percp标记的小鼠抗大鼠CD8；R-PE标记的小鼠抗大鼠INF-r；R-PE标记的小鼠抗大鼠IL-4。

1.2试验方法：

1.2.1动物模型的建立及分组：

   实验室室温24～26℃。实验动物饲养3d以上，术前称重，大鼠采用0.1%戊巴比妥钠按照0.4ml/100g剂量腹腔注射麻醉后，沿腹正中线作一1.5cm长的切口，在血管弓内结扎末端1／2盲肠，用7头号皮针头在盲肠上穿通2次形成盲肠漏，然后将盲肠还纳腹腔，10号丝线逐层缝合腹壁切口，术毕，立即皮下注射林格平衡液50ml/kg抗休克，对照组动物只开腹、关腹与复苏，但盲肠不结扎与穿孔，动物随机分为4组：正常对照组(18只)、脓毒症模型组（18只）和利复星组(18只)，血必净组（18只）每只大鼠于晨8时给予食物20g，自由饮水。各组大鼠观察至3、24、72小时时相点处死，分别留取血液与组织标本待测。

1.2.2给药方法：

   术前半小时给药一次，后每日同时间给药，假手术组、模型组給予等容量的生理盐水，各组按照1ml/100g的容量给药，每天一次。

1.2.3指标项目及检测方法

   处死取动物后取血清应用改良的基质显色法检测血清中的内毒素水平，处死动物无菌取动物脾脏，应用流式细胞仪监测HLA-DR水平。脾细胞制备及增殖测定：MTS-PMS 法。用完全RPMI-1640 培养液调整细胞密度为2×10⁶/ml。于96孔细胞培养板中加入脾细胞悬浮液。除阴性对照孔外，其余各孔均加入终浓度5g/ml的ConA。脾细胞加ConA的孔为阳性对照孔，试验孔在此基础上再加入10l已稀释的酪蛋白酶解产物。阴性对照孔、阳性对照孔和试验孔各设3个重复孔。混匀后，将96孔细胞培养板放入37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。72h后，每孔加20lMTS-PMS混合液，37℃显色4h，用酶标仪于520nm下测定OD值。Casepse3我们应用免疫组化的方法进行检测脾石蜡切片的阳性表达，引用image-pro软件分析测定免疫组化的阳性面积与阳性指数，阳性指数=阳性面积×平均光密度。

1.3统计学处理

   实验数据用SPSSl1.0软件包进行统计处理。统计学方法:所有数据(ｘ±ｓ)表示，方差齐、数据成正态分布者，计量资料采用方差分析，组间比较采用q检验，计数资料采用卡方检验；如果数据分布不正态，或方差不齐，采用秩和检验。以p<0.05为差异具有显著性。

2.结果

   2.1不同组别各时间段内毒素含量的比较

   3小时时模型组与各组比较内毒素明显上升,利复星比血必净组有所升高,但无统计学意义（p=0.068）,与正常组比较各组均明显升高。24小时模型组仍然明显升高，与利复星组比较血必净组与正常组明显下降(p=0.012)，正常组与血必净组比较无显著意义（p=0.809）。72小时模型组内毒素仍然保持高水平(p=0.000),较其他组明显升高,与利复星比较正常组与血必净组明显降低(p=0.000),正常组与血必净比较无显著意义（p=0.395）。

表1 不同组别各时间段内毒素含量的比较

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