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不同浓度七氟醚可双向调节大鼠学习记忆及海马ARC蛋白表达
背景：术中知晓和术后认知功能障碍是困扰麻醉医师的棘手问题。以往多认为与全身麻醉药物对神经系统的影响有关。但近来不断有实验研究证实，低浓度吸入麻醉气体在特定环境下反而会兴奋大脑功能，甚至产生脑保护的作用。显然全麻药物对大脑认知功能的影响机制仍未明瞭。全身麻醉药物七氟醚已广泛应用于各类临床手术，其对哺乳类动物中枢神经系统是否及如何产生影响是我们一直在探讨的课题。细胞骨架蛋白ARC可在大脑海马结构大量表达，已证实可依据其表达情况来考察神经元的活性，以及突触可塑性的变化。目前认为其表达程度可作为检测学习记忆形成的指标。近来有学者发现，较低浓度的七氟醚可引发中枢神经兴奋现象，并猜测亚麻醉剂量对于中枢神经系统具潜在保护作用。为进一步证实这一现象，本研究拟结合ARC蛋白和抑制性逃避（inhibitory avoidance，IA）这一行为学实验来进行深入探讨。 方法：250~300g雄性SD大鼠随机分为3组：空白组、极低浓度七氟醚吸入组（0.11%SEV）和低浓度七氟醚吸入组（0.3%SEV）。依据分组依次将大鼠安置于连接有低流量（0.5L/min）闭合环路吸入麻醉系统的特制容器内，分别给予吸入空气、0.11%SEV（0.05MAC）和0.3%SEV（0.14MAC）各45min。结束后马上进行单次IA训练（0.4mA，2s），24小时后进行IA记忆（潜伏期）检测。另取一批大鼠在IA初次训练后45min处死取材，以Western-blotting方法检测脑内海马ARC蛋白的表达水平，以real-time PCR方法检测ARC的mRNA转录水平。 结果：与吸入空气组相比，0.11%SEV组的24小时IA记忆潜伏期明显延长，而0.3%SEV组的24小时IA记忆潜伏期缩短；相应地，0.11%SEV组的海马ARC蛋白表达增加，而0.3%SEV组ARC蛋白的表达减少。但ARC的mRNA水平却始终无显著差异。 结论：吸入不同浓度的七氟醚能对大鼠的学习记忆能力产生双相作用，这种现象伴有海马蛋白ARC表达的相应改变，却没有相应mRNA水平的改变。提示提示全麻药物七氟醚对于记忆的双向调节存在即可早期基因如ARC对神经元突触可塑性的作用，但这种干预可能体现在转录后水平。 关键词：七氟醚；ARC；海马；抑制性逃避；学习记忆 大量研究证明吸入性全身麻醉药在达到0.3的最小肺泡浓度（MAC）时即可抑制哺乳动物的学习能力并产生遗忘效应[1-7]。Gorski[8]等人更通过逃避性抑制（Inhibitory avoidance, IA）这项检测大鼠学习记忆能力的实验得出，达到一个24小时的长时遗忘效应的药物剂量不仅与麻醉药本身种类有关，而且所需最小浓度低于预期估计值。然而意外的是，Alkire等还发现了预先给予极低浓度的氟烷（如0.1MAC）能显著改善IA实验结果，尤其是24小时后的记忆保留度。七氟醚为广泛应用于临床的吸入性全身麻醉药物，因此其安全性和精确应用剂量为临床所关注，而目前七氟醚对中枢系统的具体作用机制尚不明朗，因此，若能检测不同剂量七氟醚在记忆调节中的作用，并进一步探索这些浓度是如何作用于大脑神经系统的，必将丰富我们对七氟醚的临床和理论认识。 细胞骨架蛋白（activity-regulated cytoskeletal protein, ARC）[9]不但在突触可塑性形成和长时记忆的巩固中发挥重要的作用，它的表达也可作为检测长时记忆巩固的指标，已证明在海马、皮层等部位它较为活跃，而大脑的海马结构被认为是“掌管”学习记忆能力的关键部位，因此本实验基于上述背景，建立不同浓度七氟醚吸入的大鼠模型，利用检验大鼠学习记忆的经典行为学实验——抑制性逃避，检验麻醉药对记忆习得与巩固的调节，并以海马ARC蛋白表达的变化作为评判记忆在海马巩固加工的指标。 MATERIALS AND METHODS 动物： 选取健康清洁级雄性SD大鼠45只（体重250-300g），由上海交通大学医学院动物科学部提供。在严格的生物实验条件下饲养一周,并培养固定的昼夜节律。按照将要给于的药物剂量将大鼠平均分为空气吸入组（sham组），极低浓度七氟醚吸入组（0.11SEV组，0.05MAC）和低浓度七氟醚吸入组（0.3%SEV组，0.14MAC）。 麻醉： 在IA训练当日从各笼中取出大鼠，称重后按分组依次放入自制的链接麻醉紧闭环路的无色透明有机玻璃箱中，箱中早已预冲目标浓度的相关气体，麻醉气体按0.5L/min的流量持续从挥发罐吹出并维持整个麻醉期间（至少45min）箱中的恒定药物浓度。在麻醉结束之后，快速从箱中取出大鼠，放入IA训练箱中，进行学习训练。 行为实验： IA训练是利用大鼠趋暗喜黑的天性，检测大鼠情绪相关记忆的一种方法。 单次IA训练的原理和方法：IA训练仪由一个亮室和一个暗室组成，两室之间有一道梯形升降门。首先将大鼠背朝隔离门置入IA训练仪的亮室中，当大鼠面向升降门时，把门升起，暴露暗室。喜暗的天性会使大鼠选择进入暗室探索，当大鼠四足全部迈进暗室时即将梯形升降门关闭，给予大鼠足部单次电击（0.4 mA， 2秒）。随后将大鼠取出。大鼠在亮室时间上限为100秒，超过即剔除。 24小时后检测大鼠IA记忆：将大鼠再次背朝隔离门置入IA训练仪的亮室中，当大鼠面向升降门时，把门升起，暴露暗室。记录大鼠在亮室停留的时间（潜伏期），潜伏期越长代表大鼠记忆越好（因为记住了暗室的恶性电击事件，而不急于依照天性“贸然行事”）。在记忆检测的过程中，大鼠进入暗室后不再给予足底电击。潜伏期上限为600秒，超过亦记作600秒。 在完成记忆检测后即刻在乙醚深麻醉下断头处死，冰上操作取出大鼠脑组织，迅速完整分离出双侧海马组织置于液氮保存。 Western-blotting: 每侧海马组织加入1mL裂解液。匀浆器冰上操作，粉碎后4度，9500 r/min离心20 min，取上清液经BCA（bicinchoninic acid）法定量组织蛋白，加入上样缓冲液变性，每孔上样25 μg。电泳、湿转、封闭后加入一抗1：1000稀释，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加入二抗室温孵育1 h。TBST洗膜3次，ECL发光。 Real-time PCR： 根据GenBank提供序列，利用Primer Premier5.0软件进行设计，设计序列为：β-actin：上游引物为 5′- CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3′，下游引物为 5′-TCATCGTACTCCTGCTTGCT -3′；目的基因ARC：上游引物为5′- AGGGAGGTCTTCTACCGTCT -3′，下游引物为 5′- AGTGTAGTCGTAGCCATCAGC-3′。 完整分离大鼠海马组织，以Trizol法抽提海马总RNA，采用Promega试剂盒逆转录体系合成cDNA，将反转录获得的cDNA稀释10倍（模板量要求为50pg-100ng）,反应体系10ul为：(ddH2O 2.5ul)+(mixture 5ul)+(probe/primers 0.5ul)+(cDNA 2ul)。反应条件为：50℃ 2min—95℃ 10min—(92℃ 15sec—60℃1min)×40cycles，以Roche LC480 PCR仪进行real-time PCR。 统计： 采用SPSS 11.5软件包行统计分析。所有数据表示为均数和标准差的形式。组间比较采用方差分析法(ANOVA)。随后采用Dunnett post hoc tests确定组间比较的统计学差异（sham组为对照组）。所有的统计分析中，P <0.05认为有统计学差异。 RESULT 45只大鼠均顺利完成行为IA实验。sham组大鼠(n=15)，平均潜伏期为83.63±43.57s ；0.11%SEV吸入组大鼠(n=15)表现为记忆增强，其潜伏期为164.13±12.54s(与sham组相比，P=0.003)；0.3%SEV吸入组大鼠(n=15)表现为存在遗忘，其潜伏期为32.75±18.46s (与sham组相比，P=0.031)。（见图1）
与sham组相比较，0.3%SEV显著降低ARC蛋白的表达，而0.11%SEV却增强了ARC蛋白的表达（P值均小于0.05，见图2）。real-time PCR检测显示与sham组相比较，0.11%SEV组和0.3%SEV组的mRNA表达均无显著改变（P值均大于0.05，见图3）。
作为全身麻醉的重要特性之一，全麻药物影响大脑认知功能的机制仍未阐明。学术界公认的理想全身麻醉药物应具备两个条件：首先，在药物作用期间能完全阻断记忆的形成；其次，药物应没有神经毒性，在代谢清除之后对学习记忆功能不再有影响。但现有的全麻药物并没有我们所期盼的调节记忆的“全或无”的特征，而是通过作用于多个环节对记忆产生影响。术中知晓（Intraoperative Awareness）和术后认知功能障碍（Postoperative cognitive dysfunction，POCD）作为困扰麻醉医师的棘手问题，它们的发生与术中施行全身麻醉关系密切；而近来不断有实验发现低浓度吸入麻醉气体反而出现脑功能兴奋甚至脑保护（特定环境下）作用。经典药物异氟醚已在临床和部分动物实验中被证实对哺乳动物中枢神经活性的抑制效应，并呈剂量依赖性；近来七氟醚因其较令人舒适的气味和更低的血气分布而迅速得到普及，研究者更开始关注低浓度吸入七氟醚引发的中枢或外周神经兴奋现象。Alkire[10,11]的实验得出将小鼠暴露于遗忘剂量的七氟醚环境下，小鼠将出现学习障碍，而本实验亦证实给予大鼠约等于遗忘剂量七氟醚（相当于0.14MAC）确可产生IA训练的记忆减退，而在给予更低浓度七氟醚（相当于0.05MAC）的时候也出现了类似氟烷的IA记忆增强现象，这与研究者对于七氟醚神经兴奋作用的猜测不无一致。 近年来相继在海马发现并分别命名为ARC和Arg3.1的细胞骨架相关蛋白被统称为ARC（又称为ARC/Arg3.1），这是一种与诱导其转录的刺激在时间与空间上都相关的活性诱导基因(activity-induced gene)。如今越来越多的研究者依靠检测ARC的转录或表达水平来考察神经元的活性，以及神经元突触可塑性的变化。细胞在静息状态下，ARC的表达量很低；当细胞被“激活”后，ARC则迅速转录与表达。研究证实，凡能诱发LTP的刺激都能够诱发该基因的转录，且转录后的mRNA迅速移动、积聚在被激活神经元的树突，从而也使其蛋白表达产物定位于刺激到达的部位。而且，ARC mRNA的定位并不会被蛋白合成抑制剂阻断[12]。Guzowski等人于1999年采用荧光原位杂交技术（即catFISH）考察了ARC在细胞不同区域的分布，证实在行为训练或其它刺激诱导神经元活化的2分钟之内，ARC的mRNA前体即在核内出现。随后，经过大约20分钟，前体mRNA加工为成熟的mRNA并移至胞浆。这项研究首次为ARC的转录过程提供了时间曲线，也为以后分析神经元被激活时程的研究作出了贡献。其它研究还发现大鼠在新环境探索后，海马神经元和顶叶皮层神经元内ARC基因的转录水平与蛋白表达水平之间在30分钟至2小时内密切关联，在此期间还出现ARC蛋白表达的第一个高峰。蛋白表达的另一高峰则在8-12小时出现，有学者推测这一峰值的出现可能预示着大脑对该行为的学习加工过程已进入了下一个阶段--记忆的巩固阶段[13]。目前已认为ARC蛋白的表达可作为检测长时记忆巩固的指标，长时记忆形成时需要大脑结构在突触水平发生改变，这种学习变化即“突触可塑性（synaptic plasticity）”的具体表现。改变神经结构可能需要合成新的细胞蛋白，ARC在其中也许发挥着关键作用[14]。对于即可早期基因而言，增加蛋白表达需要更多mRNA的合成。而蛋白翻译本身是个复杂的过程，全麻药物可能通过抑制ARC转录水平、降解新合成的mRNA、抑制mRNA翻译，或是将翻译好的蛋白降解等多种途径达到减少ARC蛋白表达目的。 已证实全麻药物通过调节神经突触可塑性对学习记忆等认知功能产生影响。而作为学习记忆的中枢关键部位，海马神经元的突触可塑性与认知功能之间关系尤为引人注目，多种全麻药物均可通过该途径来干扰认知功能[15,16]。因此本实验通过观察活动刺激后海马部位ARC的表达变化，及细胞内ARC的mRNA总体水平的改变，从突触重塑的角度来检验记忆的形成。结果显示ARC的蛋白表达的确因为七氟醚吸入的浓度改变而变化，且极度浓度的吸入反而引起ARC表达的增加，这提示IA训练中出现的记忆增强效应存在海马神经元突触构造的相应改变，也符合突触可塑性改变是学习记忆的神经生物学机制这一理论。但是在检测mRNA时我们发现，给予不同浓度七氟醚吸入后ARC的mRNA增加与对照组比较并未有显著改变，这强烈提示七氟醚并非通过影响ARC转录前的记忆加工阶段来阻断学习的。结合蛋白部分的结果可以认为七氟醚对长时记忆的遗忘效应可能源自其干扰了翻译或更下游的修饰部分。当然，这些猜测都有待进一步的研究验证。 本研究得出极低浓度七氟醚（0.05MAC）可引起大鼠的IA学习记忆增强，而遗忘浓度七氟醚（0.14MAC）则导致IA学习减退。此现象与大鼠海马部位ARC蛋白的表达改变呈正相关，而ARC在海马部位的转录水平却不受麻醉药物吸入的干扰。这提示全麻药物七氟醚对于记忆的双向调节存在即可早期基因如ARC对神经元突触可塑性的作用，但这种干预可能体现在转录后水平。 参考文献 1. Eger EI II, Saidman LJ, Brandstater B: Minimum alveolar anesthetic concentration: A standard of anesthetic potency. ANESTHESIOLOGY 1965; 26:756–63 2. Cook TL, Smith M, Winter PM, Starkweather JA, Eger EI III: Effect of subanesthetic concentration of enflurane and halothane on human behavior. Anesth Analg 1978; 57: 434–40 3. Dwyer R, Bennett HL, Eger EI II, Heilbron D: Effects of isoflurane and nitrous oxide in subanesthetic concentrations on memory and responsiveness in volunteers. ANESTHESIOLOGY 1992; 77:888–98 4. Ghoneim MM, Block RI: Learning and memory during general anesthesia: An update. ANESTHESIOLOGY 1997; 87:387–410 5. El-Zahaby HM, Ghoneim MM, Johnson GM, Gormezano I: Effects of subanesthetic concentrations of isoflurane and their interactions with epinephrine on acquisition and retention of the rabbit nictitating membrane response. ANESTHESIOLOGY 1994; 81:229–37 6. Kandel L, Chortkoff BS, Sonner J, Laster MJ, Eger EI II: Nonanesthetics can suppress learning. Anesth Analg 1996; 82: 321–6 7. Dutton RC, Maurer AJ, Sonner JM, Fanselow MS, Laster MJ, Eger EI II: The concentration of isoflurane required to suppress learning depends on the type of learning. ANESTHESIOLOGY 2001; 94: 514–9 8. Alkire MT, Gorski LA: Relative amnesic potency of five inhalational anesthetics follows the Meyer-Overton rule. ANESTHESIOLOGY 2004; 101:417–29 9. Lyford GL, Yamagata K, Kaufmann WE, et al. ARC, a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites. Neuron, 1995; 14: 433–45. 10. Alkire MT, Nathan SV. Does the amygdala mediate anesthetic-induced amnesia? Basolateral amygdala lesions block sevoflurane-induced amnesia. Anesthesiology, 2005; 102: 754-60. 11. Alkire MT, Nathan SV, McReynolds JR. Memory enhancing effect of low-dose sevoflurane does not occur in basolateral amygdala-lesioned rats. Anesthesiology, 2005; 103: 1167-73 12. Steward O, Wallace CS, Lyford GL, et al. Synaptic activation causes the mRNA for the IEG ARC to localize selectively near activated postsynaptic sites on dendrites. Neuron, 1998; 21(4): 741-51. 13. Ramírez-Amaya V, Vazdarjanova A, Mikhael D, et al. Spatial exploration-induced ARC mRNA and protein expression: evidence for selective, network-specific reactivation. J Neurosci, 2005; 25:1761-8 14. Alkire MT, Guzowski JF. Hypothesis: suppression of memory protein formation underlies anesthetic-induced amnesia. Anesthesiology, 2008; 109(5): 768-70 15. Wei H, Xiong W, Yang S, et al. Propofol facilitates the development of long-term depression (LTD) and impairs the maintenance of long-term potentiation (LTP) in the CA1 region of the hippocampus of anesthetized rats. Neurosci Lett 2002; 324: 181-4 16. Simon W, Hapfelmeier G, Kochs E, et al. Isoflurane blocks synaptic plasticity in the mouse hippocampus. Anesthesiology 2001; 94: 1058-65
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