【摘要】 泛素-蛋白酶体系统作为细胞内局部迅速降解蛋白质的主要途径之一，其介导的蛋白质降解对LTP有重要影响。该系统可通过降解某些抑制性因子促进蛋白质合成，从而对L-LTP的维持期产生一定的正性调控作用。泛素-蛋白酶体系统本身的活性受到神经兴奋性的调节，使得蛋白质的降解作用与神经元的功能相适应。深入探讨泛素-蛋白酶体系统对L-LTP维持期的影响以及神经兴奋性对泛素-蛋白酶体系统的调控，不仅有助于更全面地了解学习记忆的分子机制，更合理地解释实验现象，还将有助于拓展认知功能障碍的治疗思路。

【关键词】 L-LTP； 泛素-蛋白酶体系统；调控；神经兴奋性；

Effects of ubiquitin-proteasome-system-mediated protein degradation in the maintenance of L-LTP

JIA Li-jie  ZHANG Fu-jun  XUE Qing-sheng  YU Bu-wei

( Department of Anesthesiology , Ruijin Hospital , Shanghai Jiaotong University , Shanghai 　200025)

【Abstract】The ubiquitin-proteasome system is one of the major pathways to degrade proteins locally and quickly in cells, and the protein degradation mediated by it has great effects on L-LTP. Ubiquitin-proteasome system regulates positively the maintenance of L-LTP by degrading some inhibitory factors to synthesize some proteins. The activity of the ubiquitin-proteasome system itself is also regulated by the neural excitation, to make the function of protein degradation in accordance with that of neurons. Extensive researches on the effects of ubiquitin-proteasome system on the maintenance of L-LTP, and on the relationship between neural excitation and ubiquitin-proteasome system not only are helpful to have a thorough understanding of the molecular mechanism of learning and memory, and explain more reasonably experimental phenomena, but also to develop and widen the idea of therapeutics for cognitive dysfunction.

【key words】L-LTP；ubiquitin-proteasome system；regulation；neural excitation；

随着分子生物学等技术的迅速发展，近年来对学习记忆在分子水平的研究有了进一步的提高。在中枢神经系统的许多区域，尤其是在海马等与学习记忆有关的脑区，长时程增强（long-term potentiation，LTP）可通过不同的分子生物学机制对学习记忆功能产生广泛而多样的作用。目前普遍认为，晚期LTP（late-phase LTP，L-LTP）需要蛋白质合成 ^[1,2]，而近来的研究^[3-6]表明L-LTP也需要泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin -proteasome system，UPS）介导的蛋白质降解，因此阐明这一作用对深入理解人类认知功能无疑具有重要意义。本文拟就UPS介导的蛋白质降解作用对L-LTP的影响以及神经兴奋性对UPS的调控的最新研究进展作一综述。

1.L-LTP概述

L-LTP是指神经细胞受到强直刺激后，在构成突触的两神经元间出现的一种信号转导持续性增强现象，一般持续时间超过8-10h，是早期LTP（early-phase LTP，E-LTP）的延续，人为划分E-LTP和L-LTP的依据为后者的发生需要基因转录和蛋白质合成。L-LTP又分为前后序贯的诱导期和维持期。诱导期不发生基因转录过程^[7]，树突内由已存在的mRNA翻译产生新蛋白质，此翻译过程的激活依赖N-甲基-D-门冬氨酸（N-methyl-D- aspartate，NMDA）受体和蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）^[8]。

在L-LTP的维持期，突触后神经元通过多种途径持续性增强信号转导，以致高频刺激去除后LTP仍可维持，这种增强反应在离体海马脑片上可持续数小时，在体则可持续数天甚至数周^[9]。其具体机制如下：1多种蛋白激酶被激活。如钙/钙调素依赖性蛋白激酶II（Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）、PKA和丝裂素激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）等。另外，高浓度Ca²⁺使钙依赖性磷酸酶活性降低。2α-氨基羟甲基恶唑丙酸（α-amino-3- hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA）受体功能增强数量增加。GluR1亚基的丝氨酸磷酸化使受体敏感性上调，细胞骨架、突触后膜致密物质（Post synaptic Density，PSD）等也与该过程有关。CaMKII将胞浆中的AMPA受体动员致突触后膜，这可能是某些只具有NMDA受体不具有AMPA受体的“寂静突触”（silent synapse）在强直刺激后转化为功能性突触的原因之一。3基因转录及蛋白质合成增加。L-LTP的维持过程不仅有蛋白质合成还需要基因转录产生新的mRNA^[7]，CaMKII、PKC、MAPK等的长期作用都可影响基因转录和蛋白质合成。cAMP反应元件结合蛋白（cyclic AMP response element binding protein，CREB）^[2]也通过促进转录翻译对维持L-LTP起重要作用。基因转录和蛋白质合成不仅是维持L-LTP所必需的，也是短时记忆转入长时记忆的重要步骤。

2.UPS概述

    真核细胞内，行使泛素化和蛋白酶体降解的整个系统被称为“泛素-蛋白酶体系统”（UPS）。 UPS可在局部迅速降解细胞内的目标蛋白，该过程具有高度时间局限性和空间定位性。泛素由76个氨基酸组成，分子量大约8500道尔顿，是一种存在于大多数真核细胞中的小蛋白，主要功能为标记细胞不需要的或受到损伤的蛋白质，使其泛素化。蛋白酶体从结构上看是一个桶状的复合物，包括一个由四个堆积在一起的环所组成的中空的“核心”，主要作用是将泛素化的蛋白质降解为7-8个氨基酸长的肽段，这些肽段可被进一步降解为单个氨基酸分子，用于合成新的蛋白质。

UPS行使其降解功能时，首先在ATP的作用下，泛素（Ub）通过其C末端甘氨酸羟基与泛素活化酶（E1）中的巯基（SH基团）相连接，两者之间形成硫酯键并使泛素活化，形成E1-Ub；然后通过转酰基反应，泛素部分从E1-Ub转移到泛素结合酶（E2）活性位点以内的半胱氨酸SH基团，形成E2-Ub；随后泛素连接酶（E3）将结合E2的泛素转移到目标蛋白，使泛素C末端的甘氨酸通过异肽键与底物蛋白的赖氨酸残基连接，由此完成目标蛋白的泛素化过程。最后，结合目标蛋白的泛素再次作为E3介导的泛素化过程的底物，形成泛素-泛素连接，最终在目标蛋白上形成多泛素链^[3] （图1）。目标蛋白上多泛素链的形成是其被蛋白酶体降解的前提。UPS的底物选择特异性主要由E3负责^[3]，E3可识别底物特异性的氨基酸序列，而蛋白酶体仅能识别多泛素链（至少四个泛素单体分子）标记。

3. UPS介导的蛋白质降解对L-LTP维持期的正性调控作用

L-LTP需要蛋白质合成，而UPS介导蛋白质降解，因此最早的推测为抑制UPS介导的蛋白质降解可促进L-LTP，该观点曾在实验^[10]中得到证实，并被理解为：UPS被抑制后，减少了早期L-LTP中新合成蛋白质（由已存在mRNA翻译而来）的降解，由此促进L-LTP的诱导过程^[8]。本文主要探讨UPS介导的蛋白质降解对晚期L-LTP（L-LTP的维持期）的正性调控作用。

早期实验^[11,12]发现缺少E3连接酶基因UBE3A/E6-AP的小鼠虽有正常的基本突触传递功能，但其海马的L-LTP严重受损，学习功能障碍，提示E3连接酶在L-LTP的维持中起重要作用。Karpova等^[13]于2006年在大鼠海马脑片中转染带有荧光蛋白基因的病毒，LTP诱导后，直接观察到蛋白质合成速率和降解速率均明显增加；蛋白质合成抑制剂（茴香霉素）抑制蛋白质合成影响L-LTP，蛋白酶体抑制剂（MG132）抑制蛋白质降解，虽然几乎不影响基础突触传递水平，却明显抑制L-LTP的维持。这些现象说明，L-LTP不仅需要蛋白质的合成，也需要蛋白酶体介导的蛋白质降解，抑制蛋白酶体可显著影响L-LTP的维持。然而，当茴香霉素和MG132共同作用时，MG132可抵消前者对L-LTP的损害效应^[13]，这一现象被Fonseca等^[14]在大鼠海马脑片中重复，进一步印证了上述结论，同时作者推测神经兴奋激活的蛋白酶体降解了L-LTP维持过程中的某些抑制性调控因子，这些因子的降解与促进L-LTP因子的合成都是维持L-LTP必不可少的；当两种抑制剂共同作用时，降解与合成的平衡状态依然存在，故仍可维持L-LTP，而当只使用一种抑制剂——无论抑制降解或抑制合成——平衡状态均转为以抑制性调节为主，从而损害L-LTP的维持（图2）。依据该假说推测，L-LTP的维持过程可能需要蛋白质合成与降解的共同调控，而UPS介导的蛋白质降解可通过下调某些负性调节因子间接对L-LTP的维持产生正性调控作用。因此，当蛋白质合成功能障碍导致L-LTP损害时，UPS也可作为治疗认知功能障碍的分子靶点之一。

有意思的是，当茴香霉素先于蛋白酶体抑制剂应用时，后者对L-LTP诱导的增强作用及对L-LTP维持的抑制作用均消失^[8]。这进一步说明L-LTP的诱导及维持都需要蛋白质合成，而UPS对诱导和维持这两个过程可能存在不同甚至相反的调控方向，因此在L-LTP的不同时期（诱导期或维持期）阻滞UPS可使突触可塑性发生不同的变化。

4. UPS介导的蛋白质降解调控L-LTP维持期的分子机制

    近年来普遍认为，在神经元中UPS可通过调控转录因子影响基因表达^[15]，而蛋白酶体抑制剂也可通过干扰翻译过程而致蛋白质合成的可逆性损伤^[16]。但UPS在神经兴奋性诱导的L-LTP过程中的作用机制尚在探索阶段，Fonseca等^[14] 提出的关于“UPS降解抑制性因子”的调控模型被普遍认为具有一定的合理性。

E3连接酶基因UBE3A/E6-AP编码的蛋白质促进p53（一种抑制基因转录的转录因子）降解^[11]，缺乏该基因的细胞胞质中p53水平增高。UBE3A/E6-AP还可下调CaMKII磷酸化过程的抑制因子，进而促进CaMKII活性，缺乏UBE3A/E6-AP基因可导致CaMKII磷脂酶活性增加，CaMKII磷酸化水平下降，进而损害L-LTP的维持^[12]。CREB的磷酸化水平可影响树突棘的数量，而后者在L-LTP的维持及突触可塑性过程中起重要作用^[2]，MG132对CREB的磷酸化过程有抑制作用^[19] ，因而可间接抑制L-LTP的维持。最近一项对大鼠海马脑片的研究^[8]发现，蛋白酶体抑制剂使泛素化的ATF4（activating transcription factor 4, 又称CREB2）水平增加。ATF4可在转录水平抑制CREB，UPS对该负性转录因子的降解可间接增加CREB合成，促进L-LTP的维持。另外，蛋白酶体抑制剂使兴奋性树突内的翻译抑制因子Paip2（Polyadenylate-binding protein-interacting protein 2）积聚，导致L-LTP不能维持^[8]。UPS对另一种翻译调节因子脆性智能落后蛋白（fragile X mental retardation protein，FMRP）的降解也直接影响神经元树突及胞体的蛋白质合成^[17]。由此推测，UPS对基因表达的调控作用可能会同样影响泛素化过程中的酶的合成，从而形成一个自我调节的反馈环路^[18]。

5.神经元兴奋性对UPS的调节及相关分子机制

UPS在神经元中的作用迅速而局限，其活性只有受到神经元兴奋性的调节才能行使与神经活性相适应的蛋白质降解功能。对体外培养的大鼠海马神经元中PSD组分的研究^[19]发现，突触兴奋性改变后，多种组分（如SHANK和SAPAP等）依赖UPS途径发生降解，以使PSD发生相应的蛋白质转换；PSD蛋白的泛素化水平受神经兴奋性调节，抑制突触活性使泛素化水平降低约50%；增高突触活性则使其泛素化水平提高近2倍，这些过程均为长时程可逆过程且可被蛋白酶体抑制剂阻滞。另一项对海马神经元的研究^[20]发现，使用河豚毒素（Tetrodotoxin ,TTX）阻滞动作电位后，蛋白酶体的活性也受到抑制；而用荷包牡丹碱（Bicuculline, BIC）上调动作电位则显著增加蛋白酶体活性。这些实验表明至少在海马神经细胞中，神经兴奋性可迅速调节局部UPS的活性。

关于神经兴奋性调节UPS具体机制的研究尚处于起步阶段，其中较深入的探讨多以隐杆线虫属（C. elegans）作为研究对象，由于缺乏脊椎动物的证据其结果往往具有局限性，故不作为本文的论述范围。突触兴奋性可影响UPS在突触树突棘的再分布，通过荧光漂白恢复技术（fluorescence recovery after photo-bleaching，FRAP）分析，增加大鼠海马神经元突触兴奋性可致该突触树突棘内的蛋白酶体增加1.5倍，而其退出率（exit rate）则明显减少，使得静止性（immobile fraction）的蛋白酶体在树突棘蛋白酶体的总量中所占的比重至少增加了6倍，显然神经元对蛋白酶体的“扣留”起主要作用，该过程局限于兴奋突触并依赖NMDA受体，可能与细胞骨架肌动蛋白（actin）有关^[21]。另外，作为某些神经兴奋药物作用靶点的NAC1（nucleus accumbens-1）可介导蛋白酶体迁移至树突棘，突触兴奋性增加可促进NAC1基因的表达，促进蛋白酶体在突触兴奋时发生上述转移^[22]。突触兴奋时，UPS组分不仅发生数量的改变，其内在活性亦有明显提高，调节该过程的分子机制可能为NMDA离子通道受体复合物和L型钙通道介导的钙离子内流，进而激活CaMKⅡ使蛋白酶体亚单位Rpt6磷酸化，最终活化蛋白酶体^[20]。总之，神经兴奋性影响UPS的具体信号转导通路及分子机制虽然尚未完全阐明，但与突触兴奋性相关的NMDA受体以及胞浆内钙离子浓度等均对UPS迅速而精确的调控无疑起重要作用。

总结

    综上所述，目前的研究表明UPS介导的蛋白质降解作用对L-LTP的维持有重要意义，蛋白质的降解与合成可能同时作为调控L-LTP的分子机制。UPS本身的活性亦受神经系统兴奋性的调节，使其效应与神经系统的功能相一致。近年来的研究初步探讨了UPS调控L-LTP及神经兴奋性调节UPS的具体机制，但研究尚处于起步阶段，依然存在诸多问题亟待解决，如UPS底物分子的探索、相互之间的信号转导通路等都将是未来研究的重要方向。随着神经生物学和分子生物学的发展，实验方法和技术的改进，上述问题将被进一步阐明，这将深化我们对学习记忆机制的认识，为更合理地解释实验现象提供理论依据，也为治疗认知功能障碍开创新的思路。

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