【摘要】 目的  探讨肠系膜淋巴结（MLN）在腹腔感染状态下的免疫功能变化规律及产生机制。 方法  雄性Wistar大鼠80只，体重200～250g，随机分为假手术组（S组）和盲肠结扎穿孔组（CLP组），每组40只。分别于CLP后6h（T₁）、12h（T₂）、24h（T₃）、72h（T₄）（每个时点10只大鼠）留取腹主动脉血和MLN组织，鲎试剂偶氮显色法测定血浆内毒素水平，运用流式细胞仪测定MLN中Th1/Th2比值和调节性T细胞（Treg）占CD4⁺T细胞比例。 结果  与S组比较，CLP组血浆内毒素水平在T₂、T₃和T₄时升高，T₃时达峰值（P<0.01）；与S组比较，CLP组MLN Th1/Th2比值在T₁时升高，T₂、T₃和T₄时降低（P<0.05或P<0.01），CLP组MLN Treg比例在T₁时降低，在T₂、T₃和T₄时升高（P<0.05）；与T₁时比较，CLP组MLN细胞Th1/Th2比值在T₂、T₃和T₄时降低（P<0.05或P<0.01），CLP组MLN细胞Treg比例在T₂、T₃和T₄时升高（P<0.05或P<0.01）。大鼠MLN的Th1/Th2比值与Treg比例呈线性负相关（r=-0.871，P<0.05）。 结论  腹腔感染状态下，MLN细胞免疫功能受到抑制，表现为Th1/Th2比值减少，导致经肠道淋巴途径移位的肠源性内毒素清除减少，引发了肠源性内毒素血症的形成，其机制可能与肠源性内毒素介导MLN Treg比例增加有关。

【关键词】 脓毒症；内毒素移位；肠系膜淋巴结；T淋巴细胞，辅助诱导； T淋巴细胞，调节性

Variation of immune state in mesenteric lymph node in gut-derived septic rats    YU Wen-li，CUI Nai-qiang，DU Hong-yin．Department of Anesthesiology，Tianjin First Center Hospital，Tianjin 300192，China

【Abstract】 Objective  To investigate the variation of immune state in mesenteric lymphoid node (MLN) during gut-derived sepsis in rats.  Methods  Eidhty male Wistar rats weighing 200-250g were used in this study. Intra-abdominal infection was induced by cecum ligation and puncture (CLP). The animals were randomly divided into 2 groups: sham operation group (group S) and group CLP. Each ten rats were killed after collection of blood and MLN samples at 6h (T₁), 12h (T₂), 24h (T₃) and 72h (T₄) after CLP. Plasma concentrations of endotoxin were detected, the ratio of T helper cells 1/ T helper cells 2 (Th1/Th2) and the percentage of regulatory T cells (Treg) in CD4⁺ T cells in MLN were determined by means of flow cytometry.  Results  The levels of endotoxin were significantly higher at T₂, T₃ and T₄ in group CLP than those in group S respectively (P<0.01). The ratios of Th1/Th2 were significantly higher at T₁ and lower at T₂, T₃ and T₄ in group CLP as compared with group S (P<0.05 or P<0.01), while the percentages of Treg in CD4⁺ T cells were significantly higher at T₁ and lower at T₂, T₃ and T₄ in group CLP as compared with group S (P<0.05 or P<0.01). There was a negative correlation between the ratio of Th1/Th2 and the percentage of Treg (r=-0.871, P<0.05). Conclusion  Cellular immune function in MLN is suppressed during intra-abdominal infection by the mechanism of increased percentage of Treg, which leads to gut-derived endotoxemia.

【Key words】 Sepsis; Endotoxin translocation; T-lymphocytes, Helper-Inducer; T-lymphocytes, Regulatory

在外科危重症领域，穿孔性腹膜炎、重症急性胰腺炎、腹腔脓肿等严重腹腔感染引起的肠源性内毒素血症是导致具有高病死率的脓毒症甚至多器官功能障碍综合征的主要病因^[1]。研究发现，肠道内毒素是通过肠淋巴通路、门静脉系统和直接渗透入腹腔再吸收三种途径进入体循环，而肠淋巴系统被认为是最主要的移位途径^[2]。在腹腔感染状态下，肠道淋巴系统的免疫紊乱形成了肠源性内毒素

移位的淋巴免疫通道，是导致肠源性脓毒症的关键因素。因此，系统地研究肠道淋巴系统的免疫状态变化规律对于脓毒症的防治具有重要意义，但目前国内外尚未见该方面研究的相关报道。本研究拟针对肠道淋巴系统关键组成部分——肠系膜淋巴结（MLN）进行实验研究，探讨其在腹腔感染状态下的免疫功能变化规律及产生机制。

材料和方法

动物选择和分组  健康清洁级雄性Wistar大鼠（由军事医学科学院四所动物室提供，动物号为DD20013），体重200～250 g，在实验室使用标准颗粒饲料喂养一周，造模前禁食12h，不禁水。随机分为假手术组（S组，n=32）和CLP组（M组，n=32）。

主要仪器和试剂  FACSCalibur型流式细胞仪（Becton Dickson公司，美国），CO₂培养箱（Thermo公司，美国）。红细胞溶血素（Becton Dickson公司，美国），破膜剂（Becton Dickson公司，美国），高尔基体转运抑制剂（BFA，Becton Dickson公司，美国），佛波酯（PMA，Becton Dickson公司，美国），离子酶素（Sigma公司，美国），异硫氰酸荧光素（FITC）标记小鼠抗大鼠CD4单克隆抗体（Becton Dickson公司，美国），藻红霉素（PE）标记小鼠抗大鼠干扰素-γ（IFN-γ）单克隆抗体（Becton Dickson公司，美国），PE标记小鼠抗大鼠白细胞介素-4（IL-4）单克隆抗体（Becton Dickson公司，美国），PE标记小鼠IgG1κ同型对照抗体（Becton Dickson公司，美国），FITC标记小鼠抗大鼠CD4单克隆抗体（Biolegend 公司，美国），FITC标记小鼠抗大鼠CD25单克隆抗体（Biolegend公司，美国），别藻蓝素（APC）标记小鼠抗大鼠叉头翼状螺旋转录因子（Foxp3）单克隆抗体（eBioscience公司，美国），APC标记大鼠IgG2a同型对照抗体（eBioscience公司，美国），固定/破膜剂（eBioscience公司，美国），大鼠淋巴细胞分离液（天津灏阳生物制品有限公司），鲎试剂偶氮显色试剂盒（厦门市鲎试剂实验厂有限公司，批号071127）。

动物模型制作及标本采集  采用盲肠结扎穿孔术（CLP）制备脓毒症大鼠模型，10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后，沿腹正中线作一长2 cm 的切口，分离暴露盲肠，3-0丝线结扎盲肠根部，以18 G穿刺针横穿肠壁，挤出少许肠内容物，将盲肠放回腹腔，缝合腹壁，术毕立即皮下注射50 ml/kg林格液抗休克。S组动物只开腹、关腹与复苏，但不进行盲肠结扎和穿孔。各组分别于造模后6h（T₁）、12h（T₂）、24h（T₃）、72h（T₄）随机取8只大鼠，麻醉后解剖腹腔，无菌留取腹主动脉血1mL和MLN组织0.2g待测。

血浆内毒素测定  腹主动脉血1 mL，肝素处理，1500 rpm离心15分钟，取上清，采用鲎试剂偶氮显色法，严格按照说明书操作。

MLN单细胞悬液制备  无菌分离MLN，置于盛有预冷PBS的无菌平皿中，去掉被膜，用400目筛网过滤除去细胞团块，收集细胞，制备单细胞悬液，用冷PBS离心（300 g，5 min） 洗涤细胞2 次，弃上清。然后用含10 %胎牛血清、5×10 ^{- 6} mol/L二巯基乙醇、60 mg/L卡那霉素的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，并在低倍镜下调整细胞浓度为2×10⁶ cells/mL。

大鼠MLN单细胞悬液Th1/Th2比值测定  500 μL MLN单细胞悬液以等倍RPMI-1640稀释，加入刺激剂（PMA 5 ng，离子霉素0.5 μg，BFA 1 μg）混合， 37℃、5% CO₂孵育4小时。取出混匀后，将血样加入三只试管中（200 μL/管），分别加入FITC标记小鼠抗大鼠CD4抗体进行细胞外染色，经过溶血和破膜通透，将PE 标记的小鼠 IgG1抗体（同型对照）、小鼠抗大鼠IFN-γ抗体和IL-4抗体分别加入三只试管中进行细胞内染色。用CellQuest软件获取，收集10万个细胞，在FSC/SSC图中设门，选出淋巴细胞群， 在CD4-FITC/SSC图中设门，选出CD4⁺T细胞群。在CD4-FITC/ IgG1-PE设定阴性区域，在CD4-FITC/ IFN-γ-PE和CD4-FITC/ IL-4-PE图中计算IFN-γ^＋细胞和IL-4^＋细胞各占CD4⁺T细胞的比例，以二者之比表示Th1/Th2比值。

大鼠MLN单细胞悬液调节性T细胞（T regulatory cells，Treg）比例检测  取两只试管，各加入100μL 肝素抗凝全血或MLN单细胞悬液，每管加入FITC标记的小鼠抗大鼠CD4和CD25抗体进行细胞外染色，经过破膜通透，两管分别加入APC标记的大鼠 IgG2b抗体（同型对照）和小鼠抗大鼠Foxp3抗体进行细胞内染色。用CellQuest软件获取，收集10万个细胞，在FSC/SSC图中设门，选出淋巴细胞群，在CD4-FITC/CD25-PE图中，运用十字象限确定CD4⁺CD25⁺细胞。在CD4-FITC/IgG2a-APC图中，设定阴性区域，在CD4-FITC/Foxp3-APC图中，确定Foxp3⁺细胞比例，计算CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞占CD4⁺细胞的比例作为Treg比例。

数据采用SPSS 11. 5 统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差（  ± s）表示，组间比较采用t检验，组内比较采用单因素方差分析，Th1/Th2比值与Treg比例采用Sigmaplot 9.0统计学软件进行直线相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结  果

与S组比较，CLP组血浆内毒素水平在T₂、T₃和T₄时升高，T₃时达峰值（P<0.01）；与T₁时比较，CLP组血浆内毒素水平在T₂、T₃和T₄时升高（P<0.01）见表1。与S组比较，CLP组MLN细胞Th1/Th2比值在T₁时升高，T₂、T₃和T₄时降低（P<0.05或P<0.01），CLP组MLN细胞Treg比例在T₁时降低，在T₂、T₃和T₄时升高（P<0.05）；与T₁时比较，CLP组MLN细胞Th1/Th2比值在T₂、T₃和T₄时降低（P<0.05或P<0.01），CLP组MLN细胞Treg比例在T₁时降低，T₃和T₄时升高（P<0.05或P<0.01），见表2。大鼠MLN的Th1/Th2 比值与Treg比例呈线性负相关（r= -0.871 1，P<0.05），见图1。

讨     论

CLP 方法通过将盲肠近端结扎、远端穿孔，使动物自身肠内容物外溢造成混合性细菌感染，引起腹膜炎，被认为是进行脓毒症研究的金标准^[3]。研究证实，腹腔感染可以通过应激反应、缺血/再灌注、内毒素、细胞因子、炎性介质以及肠上皮细胞凋亡等多种因素造成肠屏障功能的损害，导致肠源性内毒素血症。根据Deitch提出的SIRS/MODS的肠淋巴假说^[4]，腹腔感染早期肠粘膜屏障功能遭到破坏，肠源性内毒素主要通过肠道淋巴系统进入胸导管然后播及全身，因此作为肠道相关淋巴组织的重要组成部分，MLN的免疫状态必然对内毒素淋巴途径移位起到重要作用。MLN为灰红色扁椭圆小体，质较软，位于淋巴管所经之处，不仅对特定物质或病原微生物有滤过作用，而且是抗原呈递的场所。正常免疫状态下，转移到MLN的内毒素由树突状细胞等抗原呈递细胞识别并产生局部免疫反应，被单核巨噬细胞在原位杀灭，但细胞免疫抑制会使移位的内毒素发生免疫逃逸继而全身播散，引发脓毒症。研究显示，T辅助淋巴细胞特别是Thl和Th2细胞功能的改变能够反映机体和局部淋巴组织的免疫功能状态，Th1细胞主要分泌IL-2、IL-12 、IFN–γ、TNF-α等细胞因子，增强宿主对微生物感染免疫性和防御功能，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等，对微生物感染有负性调节作用，Th1和Th2细胞可通过所产生的细胞因子发挥相互调节和相互制约作用，Th1/Th2的平衡变化有助于反映SIRS/CARS的失衡^[5]，因此MLN中Th1/Th2的平衡可以反应MLN的免疫状态。本研究结果显示，与假手术组比较，CLP术后12h循环中内毒素水平明显升高，同时MLN单细胞悬液Th1/Th2比值明显降低，说明腹腔感染早期MLN发生细胞免疫抑制，导致经MLN的肠源性内毒素清除减少，大量肠源性内毒素移位进入全身循环。

Treg作为免疫系统的重要调节细胞之一，在脓毒症免疫调节网络中发挥着对细胞免疫的抑制作用，近年来在脓毒症发生、发展机制研究中受到越来越多的关注。依据其发育、特异性及作用机制可将Treg分为天然Treg与获得性Treg，其中CD4⁺CD25⁺ Treg是研究较为深入的天然Treg，目前看来，Foxp3的表达对Treg细胞来说是高特异性的，因此本实验以CD4⁺CD25⁺ Foxp3⁺ T细胞来准确地代表Treg ^[6]。Treg具有免疫无反应性及免疫抑制性两大特性，Treg发挥免疫效应依赖于它与效应性T细胞（CD4⁺CD25^－ T细胞）的相对数量的变化，即Treg占CD4⁺T细胞比例的变化。临床观察和动物实验现已证实，Treg的增减决定着Th1/Th2作用主次关系的转换，同时决定着炎症反应的发展方向^[7]，脓毒症导致机体外周血Treg比例增加，从而加剧免疫抑制状态，表现为对抗原刺激不发生反应性增殖并且也不分泌细胞因子IL - 2。本研究结果显示，与假手术组比较，MLN Treg比例在造模后6h明显减少，但造模后12h明显上升，造模后24h和72h继续升高，Treg比例的变化与Th1/Th2比值的变化呈明显负相关，说明脓毒症早期在MLN即发生Treg比例的升高，导致细胞免疫的抑制，表现为Th1/Th2比值的降低，从而造成肠源性内毒素在MLN的免疫逃逸。Treg比例增高可能有两方面原因：（1）肠源性内毒素导致MLN的CD4⁺ T细胞发生凋亡，Treg对凋亡的抵抗力明显强于CD4⁺CD25^－ T细胞，导致相对比例的增加^[8]。（2）Treg表面具有广泛的Toll样受体，细胞因子、细菌及内毒素的刺激在体内外均可通过Toll样受体促进Treg增殖及存活，并增强其功能，因此移位的肠源性内毒素可以导致MLN的Treg比例和活性增加，介导了Th1向Th2的漂移^[9]。

    综上所述，腹腔感染状态下，MLN细胞免疫功能抑制，表现为Th1/Th2比值减少，即Th1向Th2的漂移，导致经肠道淋巴途径移位的肠源性内毒素清除减少，从而引发了肠源性内毒素血症的形成，其机制可能与肠源性内毒素介导MLN Treg比例和活性增加有关。

参  考  文  献

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3           Deitch EA．Rodent models of intra-abdominal infection．Shock，2005，24(1)：19-23．

4           Deitch EA．Role of the gut lymphatic system in multiple organ failure．Curr Opin Crit Care，2001，7：92-98．

5           Abbas AK，Murphy KM，Sher A．Functional diversity of helper T lymphocytes． Nature，1996，383：787-793．

6           Hori S，Nomum T，Sakaguehi S．Control of regulatory T cells development by the transcription factor Foxp3．Science，2003，299：1057- l061．

7           Wisnoski N，Chung CS，Chen Y，et al．The contribution of CD4⁺ CD25⁺ T-regulatory-cells to immune suppression in sepsis．Shock，2007，27：251-257．

8           Venet F，Pachot A，Debard AL，et al．Increased percentage of CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells during septic shock is due to the decrease of CD4⁺CD25^－lymphocytes．Crit Care Med，2004，32：2329-2331．

9           Sutmuller RPM，Morgan ME，Netea MG，et al．Toll-like receptors on regulatory T cells：expanding immune regulation．Trends Immunol，2006，27：387-393．